## 培养条件

细胞培养的基本条件为DMEM培养基加入10%胎牛血清（FBS）及1%青霉素-链霉素（P/S），并确保细胞为贴壁生长。培养温度设定为37℃。

## 传代方法

首次建议按1:2的比例进行细胞传代。每隔两天更换培养基。为确保细胞的优质状态，建议同时购买88858cc永利官网的优质细胞和培养基，能够获得非常优惠的价格。收到细胞后，应及时处理，待细胞状态良好后，使用完全培养基灌满瓶口并密封，这是运输细胞的最佳做法。

收到细胞后，请使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放入超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱内静置3-4小时，以使细胞状态稳定后再进行后续操作。使用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍率的照片进行保存（建议40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片为重要售后依据，若未提供照片则默认为收到状态良好。

## 细胞培养步骤

### a. 细胞传代

当细胞的汇合度未超过80%时，收集培养瓶中的完全培养基至离心管中，保留5ml完全培养基，再放入37℃、5%CO2孵箱中继续培养。如果细胞密度超过80%，则可以进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 丢弃培养上清，用不含钙、镁的PBS缓冲液洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况。如大多数细胞变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲打培养瓶并加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，确保其完全脱落后，吸出细胞悬液，转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶（分为两个T25瓶），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

### b. 悬浮细胞传代步骤

1. 半换液法：将培养瓶直立放置于培养箱中静置约1小时，轻轻吸除约3ml的培养基，然后补加3ml的完全培养基。如果培养基的颜色变化缓慢，也可直接加入约500ul的FBS；传代时可直接补充5ml培养基，分为两个培养瓶，通常这种方法可传代3次后进行一次离心，去除死细胞。

2. 离心换液法：若需分瓶，可将细胞悬液收集至离心管中，按1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养基后重悬，使其混匀，再按1:2的比例分至新T25瓶中，并添加6-8ml的完全培养基以保持细胞的生长活力。后续传代可根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

### c. 细胞冻存

1. 当细胞生长至培养瓶的80%覆盖面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。

2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养基以终止消化；再轻轻吹打细胞直至完全脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟。

3. 弃去上清，加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，如需转入液氮罐，请先在-80℃冰箱存放24小时以上再进行转移。

### d. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无冰晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁。

2. 将冻存管中的细胞转移至含有5ml完全培养基的15ml离心管中，按1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清，再用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

4. 第二天更换为新鲜的完全培养基，继续培养。

## 注意事项

某些细胞因贴壁不牢，在运输过程中可能容易脱落，这是正常现象。如细胞脱离较多，可将培养瓶中的所有培养液收集至离心管中，进行1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养。残留的细胞沉淀可加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟，然后加5ml完全培养基终止反应。再进行离心、弃去上清、重悬于1-2ml完全培养基后，按1:2比例进行分瓶传代（分为两个T25），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。