类器官（Organoids）是由干细胞或多能干细胞培养分化而形成的三维结构，能够在很大程度上模拟真实器官的结构和功能。要确保类器官实验的正常进行，判断类器官是否成熟以及在适当的时机进行传代至关重要。接下来，我们将分享如何判断类器官的成熟度以及其传代流程。

一、判断类器官成熟的标志

1. 形态学观察

成熟的类器官通常表现出均匀的大小和规则的形状。不同类型的类器官具有 distinct 的形态特征，例如肠道类器官通常呈囊状，而脑类器官可能呈现神经球状结构。一般来说，正常人体肠道类器官在培养的第12-14天可适合传代。在结构复杂性方面，成熟的类器官应展示与真实器官相似的分层结构，如肠道类器官的隐窝-绒毛结构和脑类器官的皮层样分层，这些都可以通过显微镜观察来判定。

2. 细胞组成

成熟的类器官应包含多种细胞类型，例如，肠道类器官中应有肠上皮细胞、杯状细胞和潘氏细胞等。可以通过免疫荧光染色或流式细胞术检测特定细胞标志物，如 Lgr5+ 干细胞、MUC2+ 杯状细胞。此外，成熟类器官中的细胞需要完成分化，表达成熟细胞标志物（如肠类器官的 Villin 和脑类器官的 NeuN），可采用蛋白质免疫印迹（WB）来检测预期的生物标志物。

3. 功能检测

要检测类器官的分泌功能（如肠道类器官分泌黏液、胰腺类器官分泌胰岛素）、电生理活性（尤其对于神经类器官），可通过膜片钳等技术来检测神经元的电生理活性。同时，评估类器官的代谢活性，如 ATP 生成和氧气消耗率，以及检测其是否具有预期功能，例如肠类器官的 CFTR 活性细胞、心脏类器官的自主跳动能力等。

4. 基因表达分析

利用 qPCR 或 RNA 测序技术，可以检测与成熟相关的基因表达水平，例如肠道类器官的分化标志物及脑类器官的神经元特异性基因。此外，检测类器官的 DNA 甲基化或染色质状态，以判断其是否接近体内的成熟组织状态。

二、类器官的传代流程

1. 判断何时进行传代

类器官的直径一旦达到 200-500μm，或其生长速率明显减慢，通常就需要进行传代。如果培养基颜色变黄，也表明需要传代。另外，如果类器官结构开始不规则或出现中心坏死，也应尽快传代。

2. 传代步骤

首先使用移液器轻轻吹打培养基，将类器官从基质胶中释放，之后将其转移至离心管中。接着，加入适量的消化酶并轻轻吹打类器官，使其解离成小细胞团或单细胞。这一过程的消化时间需要根据类器官的类型和消化酶的浓度进行调整，通常为 5-15 分钟。之后加入含血清的培养基以终止消化反应，并使用移液器轻轻吹打使细胞团均匀分散。然后，以 300-500g 离心 5 分钟并弃去上清液，再用新鲜培养基重悬细胞团。最后，将细胞团与基质胶混合后接种到预热的培养板中，待基质胶凝固后再加入类器官培养基，继续在 37°C、5% CO₂ 的培养箱中培养。

注意事项：

• 消化时间控制：过长可能导致细胞损伤，过短会影响类器官解离不完全。
• 基质胶品质：使用高品质的基质胶，以确保均匀分布。
• 培养基优化：应根据类器官的类型选择合适的培养基成分（如 Wnt、R-spondin、EGF 等生长因子），以确保类器官能够正常分化。
• 污染防控：需严格执行无菌操作，以避免类器官受到污染。

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